大肠癌患者外周血淋巴细胞光镜酶

　　作者: 辽宁中医学院解剖组胚教研室(辽宁 沈阳 110032) 蔡玉文 梁栋洋 蔡 朔 刘海兴 李 宁

　　关键词：结直肠癌；淋巴细胞；Mg2+ -ATP酶G-6-P酶

　　外周血淋巴细胞是机体主要免疫细胞，而正常酶活性是免疫淋巴细胞执行其免疫功能的必要保证。我们应用电镜酶细胞化学方法已经证实，大肠癌患者外周血淋巴细胞mg2+ -ATP酶与G-6-P酶活性下降，下降程度与肿瘤生物学行为相关。本研究首次应用光镜酶细胞化学方法探讨大肠癌患者外周血淋巴细胞酶活性的定位及其活性变化与肿瘤的关系。

　　l 资料和方法
　　l.l 研究对象 大肠癌组：39例，男31例，女8例；年龄27~41岁。DukesA期7例，B期17例，C期ll例，D期4例。乳头状和高、中分化管状腺癌26例，低分化腺癌ll例，黏液腺癌2例。有淋巴结转移18例，无淋巴结转移21例。对照组：正常健康志愿者l0例，年龄19~34岁(平均22.7岁)，男7例，女3例。
　　晨起安静状态下休息0.5h后，采静脉血l0ml，加入l/l0体积的肝素(110U/ml生理盐水)抗凝，充分混匀。
　　1.2 材料 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(比重1.077~1.O78，上海试剂二厂)、腺苷三磷酸二钠盐、葡萄糖-6-磷酸钠盐(Sigma公司，美国)。其它试剂均为国产分析纯制剂。低温高速离心机(HermleZK380，BHG，德国)，Olympus多功能显微镜(日本)。
　　1.3 方法
　　1.3.1 淋巴细胞分离：取肝素抗凝静脉血无菌生理盐水稀释l倍后，经淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque，离心2000r/min，20min。收集中层液面淋巴细胞，用l0倍量2%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol，pH7.4)，4C固定lh，将固定材料离心与8%蔗糖液漂洗各3次，涂片。
　　1.3.2 酶细胞化学染色：按Бyхвалов及我们自已的改良法。各组以不含底物的标准孵育液作阴性对照。2%硫化氨显色1min，自来水洗，干燥，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
1.3.3 结果判定：在Olympus多功能显微镜下观察、摄片。观察酶反应颗粒在淋巴细胞内的分布位置。以酶反应颗粒大小、数量多少、密度大小为酶活性判断依据，分为阴性(-)、阳性(+)、强阳性(++)。
　　1.4 统计学处理 采用Ridit分析，组间比较采用X2检验。

　　2 结 果
　　2.1 酶的定位与活性变化 Mg2+ -ATP酶定位在淋巴细胞膜内侧，颗粒密度大，呈线性分布，有的成融合状。酶活性：(++)(图l)。
　　G-6-P酶定位在淋巴细胞质内，可见散在的酶反应颗粒，颗粒密度大，酶活性：(++)(图2)。
　　2.2 大肠癌组Mg2+ -ATP酶和G-6-P酶活性大肠癌患者血淋巴细胞Mg2+-ATP酶与G-6-P酶活性下降，酶反应颗粒明显减少，有的为阴性(图3，4)。两种酶活性明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表l。
　　2.3 酶活性变化与肿瘤组织类型关系 高分化癌组两种酶阳性率明显高于低分化癌组，有统计学意义(P2.4 酶活性变化与淋巴结转移的关系 有淋巴结转移组其两种酶阳性率明显低于无淋巴结转移组(P<0.ol，P<0.05)，见表3。

　　3 讨 论
　　在正常生理条件下，淋巴细胞的细胞膜标志酶Mg2+ -ATP酶与代谢标志酶G-6-P酶在淋巴细胞内具有严格的布局位置，高度严密而有序地存在并发挥其重要的催化作用，从而保证细胞内错综复杂的生化代谢反应井然有序地进行，完成其免疫功能。本研究提示机体在肿瘤抗原作用下，大肠癌患者外周血淋巴细胞Mg2+ -ATP酶与G-6-P酶活性下降。Mg2+ -ATP酶活性下降必将导致淋巴细胞膜内外物质运输、膜电位改变、膜信息传递等功能受到破坏。G-6-P酶活性下降必将导致淋巴细胞内糖原异生过程受到影响，细胞内某些物质合成速度减慢，有丝分裂指数下降，DNA与RNA合成速度减慢。本研究进一步用光镜细胞化学方法证实，淋巴细胞免疫功能降低可能与淋巴细胞酶活性降低及淋巴细胞内参与糖代谢酶活性下降有关。
　　本研究也进一步揭示，在大肠癌的形成与发展过程中，患者外周血淋巴细胞酶活性下降程度与肿瘤的分化程度、生长方式、浸润深度及有无淋巴结转移等生物学行为相关，即酶活性下降越多，淋巴细胞的正常免疫功能越低，对肿瘤的生长、扩散、转移等的抑制作用将越小。本文应用光镜酶细胞化学方法，对大肠癌患者外周血淋巴细胞酶活性研究的结果与我们用电镜酶细胞化学方法证实大肠癌患者外周血淋细胞Mg2+ -ATP酶与G-6-P酶活性下降结果相同。肿瘤宿主机体免疫功能下降的原因是多方面的，其机理尚未完全明了，大肠癌患者外周血淋巴细胞酶活性的变化，是否在骨髓发生过程中已出现异常及可能与肿瘤细胞产生的免疫因子有关等有待深入探讨。